Полный курс за 3 дня. Микробиология - стр. 43
С помощью химического синтеза могут быть получены сравнительно небольшие гены. Для этого вначале расшифровывают число и последовательность аминокислот в белковой молекуле вещества и по этим данным узнают очередность нуклеотидов в гене, так как каждой аминокислоте соответствуют три нуклеотида. С помощью синтезатора химическим путем создают ген, аналогичный природному гену.
Полученный таким образом целевой ген сшивают с другим геном с помощью ферментов лигаз. В дальнейшем он используется в качестве вектора для встраивания гибридного гена в клетку. В качестве вектора могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы человека, животных и растений.
Количество плазмид в бактериальной клетке может колебаться от одной до нескольких сотен и зависит от размера плазмиды: чем большие размеры она имеет, тем меньше ее копий в клетке. С помощью ампфликации генов (увеличения числа копий определенного гена в клетке) можно резко повысить производство кодируемого вещества клеткой.
Бактериофаг как вектор используется аналогично. Целевой ген встраивается в геном фага, реплицируется вместе с генами вируса при размножении последнего в бактериальной клетке. Чаще всего используется фаг ламбда, содержащий ДНК из 50 000 пар нуклеотидов. Его преимущество перед плазмидами заключается в том, что фаговый вектор позволяет клонировать большие фрагменты чужеродной ДНК.
В случае использования в качестве векторов вирусов человека, животных и растений чужеродный ген встраивают в ДНК вируса. Он реплицируется вместе с размножением последнего в клетке.
Применяют в качестве вектора и космиды – гибрид плазмиды с фагом, использующийся для клонирования больших фрагментов ДНК эукариот.
Для РНК-содержащих вирусов передача генетической информации возможна с помощью ревертазы, передающей информацию о структуре белка от РНК к ДНК, являющейся комплементарной РНК.
Получение рекомбинантных молекул ДНК и рекомбинантных бактерий сводится к тому, что экспрессируемый ген в виде рекомбинантной ДНК встраивается в бактериальную или животную клетку, приобретающую новое свойство – способность продуцировать несвойственное этой клетке вещество, кодируемое экспрессируемым геном. Для лучшего проникновения вектора через стенку бактерий иногда прибегают к воздействию на стенку (например, хлоридом кальция), чтобы увеличить ее проницаемость.
В качестве реципиентов экспрессируемого гена чаще всего используют Е. coli, В. subtilis, псевдомонады, дрожжи, вирусы с учетом возможности встройки чужеродного гена, а также уровня выраженности (экспрессии) синтеза вещества, кодируемого геном, возможности его секреции в окружающую среду, легкости и доступности массового культивирования, экологической безопасности. Некоторые штаммы рекомбинантных бактерий способны переключать на синтез чужеродного вещества, экспрессируемого геном, до 50 % своего синтетического потенциала, поэтому они нашли применение в биотехнологической промышленности и называются промышленными штаммами.